肥満気味の体格に団子鼻で、鼻下には立派なヒゲを蓄えている。
普段は赤いシャツに青いデニムのオーバーオールを着て、『Ｍ』と書かれた赤い帽子と白い軍手を身につけている。
デビュー作品の『ドンキーコング』ではシャツとオーバーオールの色が逆で、『スーパーマリオブラザーズ３』頃までは両方の配色が混在していた。
体型に似合わず体力や運動神経は常人よりもはるかに上であり、特にアクロバティックなジャンプを得意とする。
また、手から炎を発する魔法のような技もいくつか扱える。
帽子は防具になっており、帽子がないと受けるダメージが大きくなる。
年齢は２６歳前後であるが、『スマッシュブラザーズ』シリーズでは『ナイスミドル（質の良い中年男）』と表記されていた。
また、１９９６年のゲーム雑誌『電撃ＮＩＮＴＥＮＤＯ６４』内でマリオのプロフィールについて任天堂の広報に質問した際は『ブルックリン在住のイタリア系アメリカ人、２４歳』と答えている。
職業は元々は配管工で後に冒険家に転業したことになっている。
これらの職業や、作品中で多数のコインを集める行為から、アメリカの経済誌『フォーブス』による架空の長者番付において１０億ドルの資産を持つ男として紹介されている。
マリオ城という自分の城を自分の国であるマリオランドに持っているが、出てきたことはあまりない。
マリオのフルネームはマリオ・マリオであるとされる。
これは、マリオのフルネームを決める際に、『マリオブラザーズ（マリオ兄弟）』から、マリオ・マリオとつけられた。このため、ルイージのフルネームもルイージ・マリオとなっている。
マリオの外見は、表現力の乏しかった１９８０年代初めのコンピュータで、最大限に視認性とキャラクター性を持たせようとして宮本茂がデザインした結果できたものである。
当時のドット数では髪の毛の表現が非常に困難であった為に苦肉の策として頭には帽子を被らせ、口の形が表現しづらかった為にヒゲをつけ、走るときの手の動きが良く分かるように目立つ色のオーバーオールを着せた。
当初は特に名前の設定はなく、『ミスター・ビデオゲームもしくはミスター・ビデオ』という仮称で呼ばれた。
宮本茂が『マリオ』と名付けたのはアメリカのニンテンドーの倉庫番（もしくは清掃員）のおじさん（もっと上層部の男性という説もある）がこのキャラクターと似ていた為に、その名前（Mario Segali）を頂いたものという説がある。